[Biyoloji] DNA Dizileme – DNA Dizi Analizi | DNA Dizileme – DNA Dizi Analizi Gen Yapısı Ve Genetik Kontrol Mekanizmaları Hakkında Bilgi Verir

DNA Dizileme – DNA Dizi Analizi

DNA dizi analizi veya DNA dizileme, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında birçok bilgi edinmemizi sağlamıştır.

1940’larda DNA baz kompozisyonu saptama yöntemleri bulunmasına karşın DNA’daki nükleotid diziliÅŸlerinin doÄŸrudan kimyasal analizi 1960’larda geliÅŸtirilip kullanılmaya baÅŸlanmıştır. Ä°lk yöntemler, proteinlerdeki amino asit dizisinin saptanmasında kullanılanlara dayanıyordu. Bunlar zor ve zaman alıcı yöntemlerdi. ÖrneÄŸin, 1965’te Robert Holley, 75 nükleotidlik bir tRNA molekülünün dizisini bir yıllık bir çalışma sonucu saptayabilmiÅŸti.

1970’lerde daha etkin ve doÄŸrudan nükleotid dizi analizine yönelik yöntemler geliÅŸtirilmeye baÅŸlanmıştır. Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA fragmanları elde edilmesini saÄŸlayan rekombinant DNA tekniklerinin geliÅŸmesine paralel olarak dizi analizi yöntemleri de geliÅŸtirilmeye baÅŸlanmıştır. Allan Maxam ve Walter Gilbert’in kimyasal yöntemi DNA’nın belirli bazlardan kırılmasına dayanmaktadır. Fred Sanger ve arkadaÅŸlarının geliÅŸtirdiÄŸi ikinci yöntemde ise belirli bir bazda sonlanan bir DNA zinciri sentezi gerçekleÅŸtirilmektedir. Bu yönteme dideoksinükleotit yöntemi de denmektedir.

Walter Gilbert ve Frederick Sanger DNA dizi analizi üzerine yaptıkları çalışmalardan dolayı 1980 yılında kimya alanında Nobel ödülü kazanmışlardır

Her iki yöntemde de dizisi saptanacak DNA’ya dört ayrı reaksiyon uygulanmaktadır (her baz için bir tane). Bu dört reaksiyonun ürünleri, bir nükleotid uzunluÄŸu kadar farklı, bir dizi DNA parçacıklarıdır. Dört reaksiyonun ürünleri bir jelde dört ayrı kuyucukta yan yana elektroforez ile ayrıştırılmaktadır. Jel hattındaki her bir bant belirli bir baza karşılık gelmektedir ve jeldeki bantlardan DNA parçacığının dizisi okunabilmektedir.

Maxam-Gilbert yönteminde, dizisi saptanacak DNA parçacığının komplementer zincirleri ayrılıp, 5’- ucundan, polinükleotid kinaz enzimi kullanılarak ile işaretlenir. Bu işaret, elektroforez sonrası belirli bir DNA parçacığının tanınmasını sağlamaktadır. İkinci adımda ise, dört ayrı tüpteki DNA örneğine, zinciri belirli nükleotidlerden kıran dört ayrı kimyasal reaksiyon uygulanır. Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpe farklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış moleküller elde edilir. Sonuçta, kırıldığı noktaya göre, hepsi 5’- ucundan işaretli ancak boyları farklı bir dizi parçacık elde edilir.

DNA’nın kırıldığı dört farklı reaksiyonda, guaninden (G>A), adeninden (A>G), yalnız sitozinden ya da sitozin ve timinden (C+T) kırılma olur. Bu reaksiyonlarda, purinlerin kırılmasında dimetilsülfat kimyasalı kullanılır. Nu reaktif, adenine göre guanini daha etkin olarak metiller ve ısı uygulandığında zincir metillenmiÅŸ bölgeden kırılır. Bu durumda daha çok guaninden zincir kırılması gerçekleÅŸir (G>A). Asit ortamında ise bunun aksine adeninden kırılan zincirler daha fazladır (A>G). Pirimidinlerin kırılma reaksiyonlarında hidrazin kullanılır. Hidrazin DNA’yı hem sitozin hem de timinden kırar. Ancak yüksek tuz deriÅŸiminde (2M NaCl) yalnız sitozin reaksiyona girer. Böylece iki reaksiyondan biri sitozini diÄŸeri sitozin ve timini (C+T) belirlemektedir.

Dört reaksiyon setinden elde edilen parçacıklara elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürümeleri sağlanır. Reaksiyonların her biri hedef bazdan kırılmış ancak farlı uzunluklarda parçacıklar içermektedir. Uygulana elektriksel alanın etkisi ile farklı uzunluklardaki parçacıklar jelde en kısası önde gitmek üzere yol alır. DNA parçacıklarının 5’- ucu radyoaktif işaretli olduğu için, elektroforez sonrası jelin üzerine röntgen filmi konulup gerekli süre bekletilerek otoradyografi yapılır. Görüntülenen bantlar aşağıdan yukarıya doğru okunur.

Enzimatik DNA sentezine dayanan Sanger’in DNA dizi analizi yönteminde, dizisi saptanacak olan DNA zinciri için kalıp olarak kullanılır. Sentez reaksiyonu DNA polimeraz 1 ile kataliz edilir. Yöntemde, kimyasal deÄŸiÅŸikliÄŸe uÄŸratılmış (modifiye) dideoksinükleotid trifosfatlar kullanılarak bir dizi DNA parçacıkları elde edilir. Dideoksinükleotid trifosfatlarda 3′-OH gurubu bulunmaz. Bu durumda, molekül yeni sentezlene DNA’ya katılır ancak 3’-OH gurubu taşımadığı için kendisine nükleotid ilave edilemez ve zincir sentezi sonlanarak bir DNA parçacığı elde edilir. Deneyde, dört reaksiyon karışımı hazırlanır. Her bir reaksiyon karışımı kalıp DNA zinciri, bir primer, radyoaktif nükleozit trifosfatların dördü ve az miktarda dideoksiribonükleozit trifosfatlardan sadece birini içerir. Zincir sonlanması için dört reaksiyon tüpünde farklı bir dideosiribonükleozit trifosfat bulunur. Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleozit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak, bir dizi DNA parçacığı meydana getirir.

Sentez sonrası, dört reaksiyondan elde edilen radyoaktif DNA parçacıklarıelektroforez jelinde yan yana dört ayrı kuyucukta yürütülür. DNA bantları otoradyografi görüntülenir ve ve Maxam-Gilbert yönteminde olduğu gibi jel aşağıdan yukarı doğru okunarak nükleotid dizisi saptanır.
DNA dizi analizi ile birçok organizmanın genlerinin yapısı ve organizasyonu hakkında önemli bilgiler elde edilmiştir. Virüslerin tüm genomları, E. coli ve maya gibi birçok organizmanın genomları aydınlatılmıştır.

Kaynak: Kadim Dostlar ™ Forum

Bu içerik 21.11.2009 tarihinde Hale tarafından, Fizik - Kimya - Biyoloji Konu Anlatımları bölümünde paylaşılmıştır ve 1208 kez okunmuştur. Bu içeriğin devamında incelemek isteyebileceğiniz 0 adet mesaj daha bulunmaktadır.

[Biyoloji] DNA Dizileme - DNA Dizi Analizi | DNA Dizileme - DNA Dizi Analizi Gen Yapısı Ve Genetik Kontrol Mekanizmaları Hakkında Bilgi Verir orjinal içeriğine ulaşmak için tıklayın ...